用SPEX 組織研磨儀高通量破碎96孔板中的酵母菌

多年生化、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的研究成果已經(jīng)使得酵母菌成為一種的基因表達研究和蛋白質(zhì)重組表達的通用宿主，成為生物系統研究的模式型生物，是生物制藥科學(xué)家的有力工具。盡管包括Pichia、Hansenula、Debaryomyces均被研究者所使用，但使用zui普遍的依然是Saccharomyces酵母。

酵母菌mRNA 和細胞內蛋白，很難用傳統酶解方法完整提取。裂解酶中通常含有核糖核酸酶和其他蛋白酶，它們不僅會(huì )破壞細胞壁，且會(huì )破壞特定分子。另外，酶解產(chǎn)生的原生質(zhì)體，需借助特定試劑進(jìn)行溶解，而導致很多蛋白質(zhì)變性失活。因此常常需要使用物理方法破碎酵母菌，從而釋放內容物。

通常的壓榨或球磨方式，每次只能處理一個(gè)樣品，操作效率太低。對于那些需要進(jìn)行高通量篩選檢測酵母菌的實(shí)驗，單個(gè)處理是一個(gè)主要的瓶頸和不切實(shí)際的，所以我們就需要一種可以單次高通量裂解細胞的方法。Geno/Grinder組織研磨儀——一個(gè)zui初是為了在深孔板中高通量破碎種子而設計的垂直振蕩研磨儀就可以很好的解決這一問(wèn)題?？?/span>同時(shí)在6個(gè)96孔深孔板中對酵母菌進(jìn)行破碎。實(shí)現高通量地裂解酵母。

材料和方法：

釀酒酵母在YPD培養基（(1% 酵母提取物, 2% 蛋白胨, 2% 葡萄糖)）中30°C下150 rpm振蕩培養一整夜，使用無(wú)菌96孔板（CorningLife Science），每個(gè)孔中加入100 ml 培養液和酸洗的玻璃珠(Sigma,G-8772)。使用一系列不同尺寸的玻璃研磨珠（106 目 (非常小),150-212 目,212-300 目,425-600 目(大).）對照組酵母菌中只加入培養液不加玻璃研磨珠。蓋上橡膠密封墊密封后放入Geno/Grinder動(dòng)植物組織研磨機內，固定好。 1500轉/分鐘下振蕩5-10分鐘。完成后，用相差顯微鏡檢查酵母培養物并拍照。

結果和討論：

酵母裂解的有效性取決于玻璃珠的大小和研磨持續的時(shí)間。圖1-3是用425-600目玻璃珠振蕩5-10分鐘的細胞裂解的效果。在裂解細胞時(shí)，玻璃珠的目數越低效果更差，106目的玻璃珠尤其沒(méi)有效果。結果表明425-600目的玻璃珠是裂解Saccharomyces的。

Geno/Grinder組織研磨儀的*設計也是裂解過(guò)程中一個(gè)重要的因素。標準的珠磨研磨機適應微孔板的應用模仿“油漆攪拌器”設計，呈8字形運動(dòng)。這種運動(dòng)方式不能使樣品得以均一的裂解，樣品間差別很大。而Geno/Grinder的垂直振蕩模式則能有效的裂解多孔材料中的樣品，這種上下垂直運動(dòng)方式使得玻璃珠更直接的碰撞細胞（而不會(huì )像一般的珠磨除了碰撞細胞外也常常會(huì )碰撞孔壁），從而能夠得到均一的研磨效果。

圖1. 對照組未加玻璃珠的酵母菌。10分鐘后，這些酵母菌依然完好無(wú)損。

圖2. 用425-600目玻璃珠振蕩5分鐘的細胞裂解的效果。破碎的酵母像是黑暗的“鬼魂”，完整的酵母菌則繼續折射光而呈現出明亮的部分。

圖3. 用425-600目玻璃珠振蕩10分鐘的細胞裂解的效果。絕大多數酵母菌已經(jīng)破碎呈現出黑暗的細胞“鬼魂”陰影，極少幾個(gè)酵母菌沒(méi)有被振蕩破碎而呈現出明亮的部分。

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