【Application Note】高溫下的超快多肽合成

Liberty PRIME™2.0微波肽合成器是目前蕞憲進(jìn)的肽合成系統。它基于一鍋法偶聯(lián)脫保護的固相肽合成新方法，大大減少了循環(huán)時(shí)間和廢液，達到前所未侑的水平。該系統完成一個(gè)循環(huán)時(shí)間僅為 2 分鐘 10 秒（適用于所有 20 種標準 Fmoc 氨基酸），僅產(chǎn)生 8mL 化學(xué)廢物，是 CEM 高效 Liberty Blue 2.0 肽合合器的一半。Liberty PRIME 2.0 HT24 是高通量合成標準多肽和復雜多肽的理想系統，能夠在一天內自動(dòng)合成多達 24 個(gè)肽。

傳統多肽固相合成包括重復地分別完成脫保護和偶聯(lián)步驟，中間需要清洗?；谶@樣的假設，如果沒(méi)有完荃清洗和排除上一步的廢液，將會(huì )產(chǎn)生錯誤的氨基酸插入。2013年我們的研究團隊證實(shí)，省略偶聯(lián)步驟后的清洗，不會(huì )影響多肽純度¹。Liberty PRIME 使用了如圖 1² 所示的一鍋偶聯(lián)和脫保護的新工藝實(shí)現了省略偶聯(lián)后清洗步驟。該技術(shù)涉及將脫保護試劑（堿）直接添加到偶聯(lián)后混合物中。這基于以下原理，溶液中酯鍵更高的反應動(dòng)力學(xué)能級，促使其快速水解或自縮合，從而避免樹(shù)脂上氨基官能團的潛在副反應。然后在高溫下不間斷地進(jìn)行 Fmoc 去除。試劑的優(yōu)化使用使接近脫保護步驟結束時(shí)，反應混合物為中性。這種新程序具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1.脫保護步驟的溶劑需求減少約 90%；2.脫保護后洗滌的溶劑需求減少 75%；3.更快的脫保護步驟，因為微波不需要時(shí)間緩慢下降；4.由于沒(méi)有后偶聯(lián)排放步驟，循環(huán)時(shí)間更短。

圖1. Liberty PRIME 2.0 使用的一鍋偶聯(lián)/脫保護

圖2. PRIME 2.0上使用的集成泵模塊

試劑

所有Fmoc氨基酸均購自CEM公司（Matthews ,NC）,并包含以下側鏈保護基團：Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OMpe), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Boc), Lys(Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc) and Tyr(tBu)。Oxyma Pure 和Rink Amide ProTide^® LL 樹(shù)脂也購自CEM公司。Rink Amide MBHA LL 和Fmoc-Gly-wang LL樹(shù)脂購自MilliporeSigma 公司（Burlington, MA）。N,N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、吡咯烷、三氟乙酉夋(TFA)、3,6-Dioxa-1,8-octanedithiol (DODT)、三異丙基硅烷(TIS) 和乙酸購自Sigma-Aldrich (St. Louis, 莫）。二氯甲烷(DCM)、N,N 二甲基甲酰胺(DMF) 和無(wú)水乙酉迷(Et₂O) 購自VWR (West Chester, PA)。HPLC 級水(H₂O) 和HPLC 級乙腈(MeCN) 購自Fisher Scientific (Waltham, MA)。

多肽合成

所有肽均在第一代 Liberty PRIME 系統 (CEM Corp.) 上以 0.10mmol 規模合成，使用 CarboMAX 偶聯(lián)和 一鍋法偶聯(lián)/脫保護法。在 DMF 中與 Fmoc-AA-OH/DIC/Oxyma （5/10/5）在 105 °C 下偶聯(lián) 60 秒。通過(guò)直接添加 0.5 mL 的 25% 吡咯烷/DMF到偶聯(lián)后混合溶液中，開(kāi)始脫保護步驟，并在排液前在 100 °C 下再繼續反應 40 秒。隨后進(jìn)行一次 4 mL 洗滌。使用帶有 TFA/ H2O/TIS/DODT 的 CEM Razor 高通量肽切割系統在 40°C 下進(jìn)行切割 30 分鐘。切割后肽在冷乙酉迷中沉淀并凍干過(guò)夜。

在配備有 PDA 檢測器的 Waters Acquity UPLC 系統上分析未經(jīng)任何純化的粗肽，該檢測器配備 Acquity UPLC BEH C8 色譜柱（1.7 mm 和 2.1 x 100 mm）。UPLC 系統連接到 Waters 3100 Single Quad MS 用于結構測定。在 Waters MassLynx 軟件上進(jìn)行峰分析。 使用 (i) H₂O 和 (ii) MeCN 中的 0.05% TFA 梯度洗脫進(jìn)行分離。

與 CEM 的 Liberty Blue 自動(dòng)化微波肽合成儀上使用的標準方法相比，Liberty PRIME 上的一鍋法偶聯(lián)/脫保護工藝生產(chǎn)出高純度肽，循環(huán)時(shí)間減少約 50%，化學(xué)廢物總量減少 66% 。Liberty PRIME 上 0.10 mmol 規模的標準循環(huán)在脫保護和隨后的偶聯(lián)之間使用 4mL 的單次洗滌，僅產(chǎn)生 8mL 化學(xué)廢物，總循環(huán)時(shí)間為 2 分 10 秒。表 1 顯示了在 Liberty PRIME 上合成的一組八種肽的粗純度、總合成時(shí)間和總化學(xué)廢物的實(shí)驗數據。

圖3. UPLC-MS Analysis of crude 65-74ACP.

圖4. UPLC-MS Analysis of crude ABC-20 mer.

圖5. UPLC-MS Analysis of crude JR-10 mer.

圖6. UPLC-MS Analysis of crude Exenatide.

圖7. UPLC-MS Analysis of crude 7-37GLP1.

圖8. UPLC-MS Analysis of crude PNIA(A10L).

圖9. UPLC-MS Analysis of crude Parigidin-br-1.