高效色譜柱是高效液相色譜的心臟,在高效液相色譜儀的使用中,保持色譜柱的柱效、容量和滲透特性,延長(cháng)柱子的使用壽命非常重要。色譜柱使用時(shí)間后就會(huì )出現柱壓升高、柱效降低、峰形畸變和分離度降低、保留時(shí)間改變等變化,如不采取措施,將會(huì )縮短色譜柱的使用壽命,影響工作效率,并造成一定的經(jīng)濟損失。因此,有必要加強和規范色譜柱的管理,從而延長(cháng)色譜柱的使用壽命。 本文從影響色譜柱使用壽命的幾個(gè)因素出發(fā)，從管理的角度，探討色譜柱的維護與保養。
常用的色譜柱填充劑有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠、離子交換樹(shù)脂、凝膠或玻璃微球等填充劑。在化學(xué)鍵合硅膠中以十六烷基硅烷鍵合硅膠常用,辛基硅烷鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用。近年來(lái),由于蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)分離提純技術(shù)的飛速發(fā)展,離子交換色譜柱、凝膠色譜柱的應用也越來(lái)越廣。
在以水溶液為流動(dòng)相時(shí),水溶液中的微生物例如細菌容易生長(cháng),當用水溶液或有機酸緩沖液保護柱子時(shí),一些霉菌可能在色譜柱中滋生,堵塞固定相顆粒間的空隙。由于濕法填充技術(shù)的問(wèn)世,目前普遍使用的色譜柱填料直徑一般都小于10um,流動(dòng)相中的顆粒雜質(zhì)很容易先沉積在柱頭然后慢慢堵塞柱子。流動(dòng)相的pH值對色譜柱也有影響,特別是對化學(xué)鍵合硅膠填料,水溶液的pH適范圍在2~7.5之間,當pH>8時(shí),硅膠會(huì )釋出生成絮狀物堵塞柱子,且難以復原,柱效很快降低,甚至*失效。當在緩沖液中加入有機溶劑例如甲醇或乙腈時(shí),鹽類(lèi)的溶解度下降,會(huì )析出鹽沉淀,堵塞柱子。同時(shí)流動(dòng)相中的有機溶劑和鹽會(huì )腐蝕色譜柱頭的篩板,產(chǎn)生柱頭凹陷。流動(dòng)相的極性對柱子也有一定影響,對于硅膠柱,甲醇、水、冰乙酸等極性較大物質(zhì)會(huì )破壞填料,反之,對于化學(xué)鍵合硅膠,極性小的物質(zhì)如正丁醇、二氯甲烷等也起同樣的作用。堿性溶液會(huì )破壞陽(yáng)離子交換樹(shù)脂色譜柱,而酸性溶液容易損壞陰離子交換樹(shù)脂柱。
如果有少量或微量的樣品不能夠溶解在流動(dòng)相中,在通過(guò)固定相會(huì )堵塞柱子。樣品中的顆粒雜質(zhì)也會(huì )堵塞柱子。樣品組分例如糖、蛋白質(zhì)等通過(guò)柱子時(shí)會(huì )產(chǎn)生不可逆吸附,這樣固定相的活性點(diǎn)被覆蓋。樣品組分還會(huì )與固定相產(chǎn)生反應,尤其是對于氨基柱的影響較為嚴重,因為氨基易與酐、酮形成希夫(Schiff)縮合而減少活性點(diǎn),使保留時(shí)間縮短。色譜柱鍵合相基團脫落、固定相分解和活性基團變性以及會(huì )影響柱效和保留時(shí)間的顯著(zhù)改變。大多數鍵合相都是通過(guò)硅氧硅鍵(Si-O-Si)連接在硅基質(zhì)上,形成帶有有機基團的固定相Si-O-Si-R(R為CnH2n+1),硅氧硅鍵可能在水溶液中水解而斷裂,使鍵合基團脫落。
制定色譜柱管理的標準操作規程并嚴格執行。每一根新購進(jìn)的色譜柱必須造冊登記,內容包括:生產(chǎn)公司、品名、型號、規格、購進(jìn)時(shí)間、啟用時(shí)間、單價(jià)、柱內保護溶液等。色譜柱分類(lèi)存放,硅膠柱、化學(xué)鍵合硅膠柱、氰基或氨基柱、離子交換樹(shù)脂柱、凝膠柱各用一個(gè)色譜柱盒,盒上貼上標簽,注明類(lèi)別。隨柱說(shuō)明書(shū)裝入密實(shí)袋附在登記本上。每啟用一根色譜柱,在色譜柱上貼上標簽,注明啟用日期。每根柱子每?jì)蓚€(gè)月保養一次,特別是對于一些使用頻率少的柱子,因為放置時(shí)間長(cháng),容易干柱,每一次做好保養記錄。對于確已失效的柱子,做好停用記錄,不能隨意丟棄,專(zhuān)門(mén)存放,如果現用的柱子的填料需要填補,可以用存放的柱子的填料。在從事生產(chǎn)的單位的質(zhì)檢部門(mén),對于使用時(shí)間較長(cháng)柱效降低的柱子,可把它用于檢測產(chǎn)品的中間體。
色譜柱使用一段時(shí)間后,常遇到柱子被污染,柱效會(huì )有一定程度的下降,采用適當的方法對色譜柱進(jìn)行保護,可以延長(cháng)色譜柱的使用壽命。
樣品和流動(dòng)相的處理
溶解的樣品進(jìn)樣前用濾膜過(guò)濾,以除去不溶物。如果必要,需進(jìn)行樣品的預處理。流動(dòng)相中如有不純物質(zhì)將影響效,所以溶劑盡量使用色譜級別的,至少是分析純級別,流動(dòng)相使用前用微孔薄膜過(guò)濾。在流動(dòng)相的輸液管前安裝過(guò)濾器。過(guò)濾器定期用甲醇超聲清洗,如果效果不好,可用10%的稀硝酸浸泡清洗。對于堵塞嚴重的過(guò)濾器,可在火焰上灼燒后再清洗。保護柱(預柱)的使用:
對于較昂貴的色譜柱,可以在柱前加一保護柱,防止樣品中雜質(zhì)污染分析柱,對于制備柱,因其進(jìn)樣量大,使用保護柱尤為重要。
常規處理:
硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱每一次用完后用低流速長(cháng)時(shí)間的二氯甲烷或正己烷等溶劑沖洗;鍵合相硅膠色譜柱、離子交換色譜柱和凝膠色譜柱先用蒸餾水沖洗,再用甲醇沖洗,然后用甲醇與蒸餾水以一定比例混合的溶液沖洗后過(guò)夜。對于已使用一段時(shí)間后柱效下降的色譜柱可按以下方法進(jìn)行再生。再生處理包括活化(右→左)和凈化(左→右)兩種。硅膠、氧化鋁、極性鍵合相色譜柱按下列順序沖洗:*基戊烷或己烷←→三氯乙烷←→乙酸乙脂←→丙酮←→乙醇←→水。鍵合相硅膠柱:蒸餾水←→甲醇(沖洗過(guò)程中可加入少量二甲基甲酰胺)。
離子交換樹(shù)脂柱:
高濃度的NaCl溶液(1-2molL的NaCl溶液)可使大部分樹(shù)脂再生,油脂等少數與樹(shù)脂緊密結合的物質(zhì)可用低濃度堿溶液(如0.1molL的NaOH溶液)沖洗,酸性有機物吸附在固定相的用低pH緩沖液沖洗,堿性有機物用高pH緩沖液沖洗,然后再用蒸餾水←→甲醇←→二氯甲烷←→甲醇←→蒸餾水沖洗。
由于凝膠色譜柱是根據被分離物質(zhì)的分子量大小而分離物質(zhì),通常用稀的氫氧化鈉或非離子型去垢劑(0.2%-1%NP-40或Lubrol)沖洗可除去大部分的結合物質(zhì),如果一些污染物仍然不能清除時(shí),用24%或30%乙腈沖洗過(guò)夜可除去疏水蛋白,用30%-50%乙酸可除去親水蛋白,用蛋白水解酶處理可分解凝膠中剩余的痕量胃蛋白酶,然后再用蒸餾水←→甲醇←→蒸餾水沖洗。
已污染的色譜柱的處理:
因保留強的物質(zhì)污染,流動(dòng)相或樣品中不溶物沉積于柱頭,可用下列方法洗滌:去除脂類(lèi)可用C4H8O、乙腈或甲醇洗滌;去除蛋白質(zhì)可用乙腈、丙醇和1%三氯 醋酸進(jìn)行梯度洗脫;一些高疏水性化合物可用乙腈或甲醇洗脫,同時(shí)反復注入100-200ml的C4H8O。
柱頭處理:
對于柱頭堵塞污染嚴重的情況而且用溶劑沖洗無(wú)效的色譜柱,只有打開(kāi)柱子去除柱頂的填料重裝:先拆下不銹鋼燒結過(guò)濾器,檢查柱床,常見(jiàn)凹陷或受污染的帶色填料,剔去不規則床層和帶色填料,使柱床顯白色并*水平,再用甲醇作糊狀填料勻漿液,將糊狀填料勻漿液滴在柱上靠重力從勻漿液中排出甲醇液,重復直到填料水平。
柱子的貯存:
首先柱子必須清洗干凈后才能貯存,柱子不能貯存在水或水性溶劑中,否則會(huì )引起微生物的滋生。極性色譜柱可用適當溶劑如二氯甲烷沖洗;鍵合相色譜柱用甲醇沖洗;陰離子交換色譜柱用0.002%洗必泰(雙氯苯雙胍己烷)的緩沖液沖洗,陽(yáng)離子交換色譜柱用0.005%硫柳汞緩沖液沖洗;凝膠色譜柱用緩沖液中加0.02%三氮氮化鈉或用20%乙醇沖洗。再將柱子兩頭密封,以防止溶劑蒸發(fā)使柱子干燥而引起柱子結構的幾何學(xué)改變。
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